Resumo Vacinação contra Anaplasma marginale tem sido considerada uma importante estratégia de controle da anaplasmose bovina. Recentemente, camundongos imunizados com rMSP1a funcionalizada à nanotubos de carbono (MWNT) apresentaram resposta imune significante, gerando nova possibilidade para o uso da vacina inativada. O objetivo desse estudo foi investigar a resposta celular e humoral em bezerros imunizados com MWNT+rMSP1a, associado com a vacina inativada de A. marginale produzida in vitro, e avaliar os efeitos tóxicos dos MWNT nas funções hepática e renal. rMSP1 a foi ligada covalentemente aos MWNT. Vacina inativada (AmUFMG2) foi produzida através do cultivo de A. marginale em células IDE8. Vinte e quatro bezerros Holandeses foram divididos (quatro grupos) e imunizados subcutaneamente com: PBS e MWNT não-carboxilados (controle, G1), AmUFMG2 (G2), MWNT+rMSP1 a (G3), e AmUFMG2 com MWNT+rMSP1a (G4). Amostras de sangue foram coletadas para contagem de leucócitos, perfil bioquímico e avaliação da resposta celular e humoral. Imunização com MWNT+rMSP1a induziu aumento dos leucócitos totais, células NK, na população de linfócitos e altos níveis de anticorpos comparado com animais imunizados apenas com AmUFMG2. Além disso, MWNT não induziu alterações no perfil bioquímico. Esses dados indicam que MWNT+rMSP1a foram capazes de induzir eficientemente a resposta imune comparado com AmUFMG2 sozinho, sem gerar toxicidade.

Abstract Vaccination against Anaplasma marginale has been considered an important control strategy for bovine anaplasmosis. Recently, mice immunized with rMSP1 a linked to carbon nanotubes (MWNT) showed significant immune responses, generating a new possibility for use of an inactivated vaccine. The objective of this study was to investigate the cellular and humoral responses in calves immunized with MWNT+rMSP1a , associated with inactivated vaccine of A. marginale produced in vitro, and evaluate the toxic effects of the MWNT on renal and hepatic function. rMSP1a was covalently linked to MWNT. Inactivated vaccine (AmUFMG2) was produced by cultivating A. marginale in IDE8 cells. Twenty-four Holstein calves were divided (four groups) and immunized subcutaneously with PBS and non-carboxylated MWNT (control, G1), AmUFMG2 (G2), MWNT+rMSP1a (G3), and AmUFMG2 with MWNT+rMSP1a (G4). Blood samples were collected for total leukocyte counts, biochemical profiling and evaluation of the cellular and humoral response. Immunization with MWNT+rMSP1a induced increase in the total number of leukocytes, NK cells, in the lymphocyte populations and higher levels of antibodies compared to calves immunized only with AmUFMG2. Furthermore, MWNT did not induce changes in the biochemical profile. These data indicate that MWNT+rMSP1a were able to induce the immune responses more efficiently than AmUFMG2 alone, without generating toxicity.

RESUMO: A anaplasmose granulocítica equina é causada por uma bactéria gram-negativa, intracelular obrigatória, membro da família Anaplasmataceae, incluída na ordem Rickettsiales e denominada de Anaplasma phagocytophilum. Pouco se sabe sobre a doença, sua dinâmica de transmissão, diversidade genética e prevalência em Minas Gerais, Brasil. Este trabalho teve por objetivo realizar o levantamento sorológico utilizando a reação de imunofluorescência indireta, avaliação direta de capa leucocitária e nested reação em cadeia da polimerase (PCR) como métodos diagnósticos, a fim de avaliar a situação da doença em dois haras de criação de cavalos manga-larga marchador localizados nas cidades de Ataléia e São Vicente de Minas, no estado de Minas Gerais. Foi encontrada prevalência de 76% (131/172) de animais reativos para a reação de imunofluorescência indireta, quando todos os animais das duas propriedades e das duas coletas foram agrupados, e 12,8% dos animais foram positivos na avaliação da capa leucocitária. A reação de imunofluorescência indireta detectou 1,94% das amostras como positivas para o agente. Essas amostras foram submetidas ao sequenciamento de nucleotídeos, e foi observada similaridade de 96% com A. phagocytophilum proveniente de carrapatos Ixodes ricinus. Existe alta prevalência de animais positivos para a infecção por A. phagocytophilum, o que foi provado pela positividade dos animais à PCR. Novas pesquisas devem ser conduzidas a fim de entender a dinâmica epidemiológica e clínica da doença no estado de Minas Gerais.

ABSTRACT: Equine granulocytic anaplasmosis is caused by Anaplasma phagocytophilum, a gram negative, obligatory intracellular bacterium, member of Anaplasmataceae family, included in the Rickettsiales order. Little is known about the disease, transmission dynamics, genetic diversity and prevalence in Minas Gerais state, Brazil. This work aimed to do a serosurvey using indirect immunofluorescent assay (IFA) test and evaluation of buffy coat smears, and nested polymerase chain reaction (PCR) as diagnostic methods, to determine the disease situation in horses from two manga-larga marchador breeding farms located in the municipalities of Ataléia e São Vicente de Minas, in Minas Gerais state. It was found that 76% (131/172) of the animals were considered reactive for IFA test, and the total of 12.8% was positive at buffy coat smears analysis. At PCR analysis, it was found 1.94% of the samples positive to the infection. Those samples were sequenced and showed 96% of similarity to A. phagocytophilum from a Ixodes ricinus tick. There is a high frequency of animals with the evidence of contact to A. phagocytophilum on the two evaluated properties in this study, which was proved by positiveness in PCR analysis. New researches must be carried out to better understand the epidemiologic and clinical dynamic of the disease in the state of Minas Gerais.

Patógenos transmitidos por carrapatos podem resultar em sérios problemas de saúde para os ruminantes selvagens, e alguns podem ser zoonoses. O objetivo do presente estudo foi a detecção post mortem de hemoparasitos, em Mazama gouazoubira de vida livre, oriundos de Minas Gerais, através da análise de lâminas de impressão e nested PCR. Foram amostrados nove M. gouazoubira de vida livre, que morreram após a captura. Exames de necropsia foram realizados, e as carcaças foram examinadas para detectar alterações macroscópicas. Amostras dos órgãos foram coletadas para a realização de imprint em lâminas e para nested PCR à procura de hemoparasitos. A análise das lâminas mostrou pequenos trofozoítos de Piriplasmida nos eritrócitos de quatro dos oito animais examinados, e corpúsculos de Anaplasma marginale foram observados nos eritrócitos de dois dos cervídeos. A coinfecção com A. marginale e trofozoítos de piroplasmas ocorreu em dois animais. As análises de nPCR dos órgãos mostraram que seis dos nove animais estavam positivos para Theileria sp., cinco para A. phagocytophilum e três para A. marginale, sendo que a coinfecção ocorreu em quatro cervídeos. Os resultados do presente estudo demonstram que os diagnósticos post-mortem, pelas imprints em lâminas e ensaios moleculares, são métodos eficazes de detecção de hemoparasitos nos principais órgãos parasitados.

Tick-borne infections can result in serious health problems for wild ruminants, and some of these infectious agents can be considered zoonosis. The aim of the present study was the post-mortem detection of hemoparasites in free-living Mazama gouazoubira from Minas Gerais state, Brazil. The deer samples consisted of free-living M. gouazoubira (n = 9) individuals that died after capture. Necropsy examinations of the carcasses were performed to search for macroscopic alterations. Organ samples were collected for subsequent imprint slides, and nested PCR assays were performed to detect hemoparasite species. Imprint slide assays from four deer showed erythrocytes infected with Piroplasmida small trophozoites, and A. marginale corpuscles were observed in erythrocytes from two animals. A. marginale and trophozoite co-infections occurred in two deer. A nested PCR analysis of the organs showed that six of the nine samples were positive for Theileria sp., five were positive for A. phagocytophilum and three were positive for A. marginale, with co-infection occurring in four deer. The results of the present study demonstrate that post-mortemdiagnostics using imprint slides and molecular assays are an effective method for detecting hemoparasites in organs.

A anaplasmose bovina, causada pela rickettsia Anaplasma marginale e transmitida por carrapatos, é endêmica em regiões tropicais e subtropicais no mundo e causa grandes perdas econômicas na industria de bovinos. Proteínas principais de superfície (MSPs) foram usados como marcadores para a caracterização genética de amostras de A. marginale, demonstrando que diferentes isolados podem ocorrer numa certa região geográfica. Porém, no Brasil pouco se sabe sobre a variedade genética de isolados de A. marginale em rebanhos individuais. Este estudo teve como objetivo investigar a ocorrência de variação genética entre bezerros infectados com A. marginale numa fazenda do sul de Minas Gerais, Brasil. Amostras de sangue coletadas de 100 bezerros foram utilizadas para o preparo de esfregaços sanguíneos, corados pelo Giemsa, para detecção da infecção por A. marginale. Amostras de DNA extraídas de cada amostra foram analisadas através de PCR seguido de sequenciamento. O exame dos esfregaços demonstrou que 48% dos bezerros estavam infectados comA. marginale, enquanto que o PCR detectou 70,2% de positividade. Infecção congênita foi detectada em quatro bezerros. As análises de microsatélites e ‘tandem repeats’ comprovaram uma grande diversidade genética entre os isolados.

Bovine anaplasmosis, caused by the tick-borne rickettsiaAnaplasma marginale, is endemic in tropical and subtropical regions of the world and results in economic losses in the cattle industry. Major surface proteins (MSPs) have been used as markers for the genetic characterization of A. marginale strains and demonstrate that many isolates may occur in a given geographic area. However, in Brazil, little is known about the genetic diversity of A. marginale isolates within individual herds. This study was designed to examine the genetic variation among A. marginale infecting calves in a farm in the south of Minas Gerais State, Brazil. Blood samples collected from 100 calves were used to prepare Giemsastained smears that were microscopically examined for the presence of A. marginale. From each blood sample, DNA was extracted and analyzed by a polymerase chain reaction (PCR), followed by sequencing to determine diversity among the isolates. Examination of blood smears showed that 48% of the calves were infected with A. marginale, while the real-time PCR detected 70.2% positivity. Congenital infections were found in four calves. The microsatellite and tandem repeat analyses showed high genetic diversity among the isolates.